3D Nanoimaging e Single-Molecule Tracking Upgrade

Negli ultimi anni, sono stati ideati diversi metodi per ottenere immagini con risoluzione nanometrica di caratteristiche cellulari utilizzando un microscopio ottico (STED, PALM, STORM). Sebbene potenti, questi metodi sono abbastanza inefficaci nel rilevare nanostrutture sparse in un'immagine. Inoltre sono inadeguati per rilevare la dinamica delle reazioni chimiche che si verificano nella scala di tempo sub-secondo in strutture 3D di dimensioni nanometriche, che si muovono continuamente e cambiano forma.

Con l'approccio NanoImaging alla super-risoluzione, il raggio laser non scansiona il campione seguendo un modello predeterminato come è il caso nelle immagini raster. Invece, l'imaging di scansione laser si basa su un algoritmo di feedback in cui il percorso seguito dal raggio laser viene regolato continuamente e deciso durante la scansione in base alla forma dell'oggetto da immaginare. L'algoritmo sposta il punto laser a una distanza fissa dalla superficie dell'oggetto; poiché la posizione del punto laser e la sua distanza dalla superficie sono parametri noti, vengono utilizzati per ricostruire la forma dell'oggetto. Le strutture cellulari 3D possono essere risolte fino a 20-40 nm con una precisione di 2 nm in pochi secondi.

La sequenza delle operazioni per l'utilizzo del NanoImaging SMT è semplice: in primo luogo, viene acquisita un'immagine confocale dell'area di interesse; poi, l'oggetto da immaginare viene identificato dall'utente. Il nanoimaging SMT viene attivato attraverso l'interruttore e il raggio laser è posizionato a una distanza di 100-200 nm dal centro dell'oggetto. Mentre il punto laser si avvicina alla superficie da immaginare, la quantità di fluorescenza aumenta. Tuttavia, l'aumento della fluorescenza dipende dalla distanza così come dalla concentrazione dei fluorofori e dalla loro rispettiva resa quantistica. Per separare l'effetto della distanza dall'effetto dovuto alla concentrazione, la posizione del punto è costretta ad oscillare perpendicolarmente alla superficie. Cioè, l'intensità della fluorescenza cambia durante l'oscillazione (Figura 1).

Figura 1. Schematici della tecnica di tracciamento della modulazione. Il punto di raggio viaggia in un'orbita circolare intorno all'oggetto e la sua distanza dalla superficie dell'oggetto è variata periodicamente a una frequenza impostata; In genere, per ogni orbita il numero di oscillazioni è tra 8 e 32 a seconda delle dimensioni dell'oggetto. Queste piccole oscillazioni del raggio vengono utilizzate per calcolare la funzione di modulazione dell'orbita, da cui viene determinata la distanza del punto dalla superficie.
La funzione di modulazione è definita come il rapporto tra la parte alterna e la parte media dovuta alla fluorescenza locale della superficie. In pratica, la modulazione è il rapporto tra la derivata spaziale del PSF e l'intensità. La funzione di modulazione aumenta quasi linearmente in funzione della distanza dalla superficie e questa caratteristica consente il suo utilizzo per determinare la distanza del punto laser dalla superficie lungo l'orbita. In questo modo, la forma trasversale dell'oggetto viene calcolata e ricostruita.

Di seguito è riportato uno schema delle unità NanoImaging e delle sue connessioni al microscopio confocale FV1000. Una scatola di commutazione consente all'utente di azionare l'FV1000 nella modalità standard di funzionamento, o di attivare il sistema NanoImaging. Quando nell'operazione di nanoimaging, i galvo-specchi del FV1000 sono controllati attraverso l'elettronica fornita dalla ISS. Il segnale viene raccolto dai rivelatori interni della FV1000 e deviato all'unità di acquisizione dati di conteggio dei fotoni ISS. Le molecole sono tracciate nel piano XY utilizzando gli specchi galvo-controllati del FV1000 e nell'asse z da uno stadio piezo-controllato. Il controllo dello strumento, l'acquisizione dei dati e la visualizzazione sono effettuati su un computer separato.

La sezione destra comprende i componenti dello strumento (PC, elettronica di controllo, scanner e lanciatore laser). La sezione sinistra dello schema include i componenti forniti da ISS con il pacchetto di aggiornamento.

	Imaging su scala nanometrica con il metodo di tracciamento di modulazione Lanzano, L., Digman, M.A., Fwu, P., Giral, H., Levi, M., Gratton, E. J Biophotonics, 2011, 4(6), 415-24.
	Misurazione della distanza con l'immagine precisa di Nanoscale dal metodo di oscillazione rapido del fascio Lanzano, L., Gratton, E. Microsc Res Tech, 2012, 75(9), 1253-64.
	Spettroscopia e localizzazione multi-parametri in tempo reale nel monitoraggio tridimensionale delle singole particelle Hellriegel, C., Gratton, E. J R Soc Interface, 2009, 6, Suppl 1:S3-14.
	Nanomicroscopia in tempo reale tramite tracciamento tridimensionale della singola particella Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bráuchle, C., Gratton, E., Lamb, D.C. Chemphyschem, 2009, 10(14), 2458-64.
	Misura della distanza mediante scansione circolare del fascio di eccitazione nel microscopio a due fotoni Kis-Petikova, K., Gratton, E. Microsc Res Tech, 2004, 63(1), 34-49.